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土壤的稀釋分離、純化微生物及無菌操作技術

來源:青島AG视讯生物科技有限公司發表時間:2017-06-04

一、目的和內容

目的:學習從土壤中分離微生物的方法,學習無菌操作技術.

內容:

1.用稀釋法分離細菌、放線菌和黴菌.

2.用平板劃線方法分離微生物.

3.學習斜麵接種及穿刺接種等無菌操作技術.


二、材料和用具

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通變形菌(Proteus vulgaris)斜麵菌種.

牛肉膏、高氏1號、土豆蔗糖固體培養基各1瓶,49.5mL無菌水(帶玻璃珠)1瓶,4.5mL無菌水6管,80%乳酸,10%酚液,95%乙醇.

無菌培養皿12套,1mL無菌移液管10支,土壤樣品及天平、稱量紙、藥勺、試管架、玻璃鉛筆、橡皮頭(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮.


三、操作步驟

(一)土壤稀釋分離:

1、取土壤:取表層以下5—10cm處的土樣,放入無菌的袋中備用,或放在4℃冰箱中暫存.

2、製備稀釋液(要無菌操作)

(1)製備土壤懸液:

稱土樣0.5g,迅速倒入帶玻璃珠的49.5mL無菌水瓶中(玻璃珠用量以充滿瓶底力最好),振蕩5~10min,使土樣充分打散,即成為10-2的土壤懸液.

(2)稀釋:

用無菌移液管吸10-2的土壤懸液0.5mL,放入4.5mL無菌水中即為10-3稀釋液,如此重複,可依次製成10-3~10-8的稀釋液(圖 3-1).注意:操作時管尖不能接觸液麵,每一個稀釋度換用一支移液管,每次吸入土液後,要將移液管插入液麵,吹吸3次,每次吸上的液麵要高於前一次,以 減少稀釋中的誤差.

3、混菌法測定菌落數的方法

(1)細菌:取10-7、10-6兩管稀釋液各1mL,分別接人相應標號的平皿中,每個稀釋度接兩個平皿.然後取冷卻至50℃的牛肉膏瓊脂培養基,分別倒入以上培養皿中(裝量以鋪滿皿底高1.5~2mm為宜),迅速輕輕搖動平皿,使菌液與培 養基充分混勻,但不沾濕皿的邊緣,待瓊脂凝固即成細菌平板.倒平板時要注意無菌操作.

(2)放線菌:取10-5、10-4兩管稀釋液,在每管中加入10%酚液5~6滴,搖勻,靜置片刻,然後分別從兩管中吸出1mL加入相應標號的平皿中,選用高氏1號培養基,用與細菌相同的方法倒入平皿中,便可製成放線菌平板.

(3)黴菌:取10-2、10-3兩管稀釋各1mL,分別接入相應標號的平皿中,每個稀釋度接兩個平皿.在融化的土豆蔗糖培養基中,每100mL加入滅菌的乳酸1mL,輕輕搖勻,然後用與細菌相同的方法倒入平皿中,便可製成黴菌的平板.

4、培養:將接種好的細菌、放線菌、黴菌平板倒置,即皿蓋朝下放置,於28~30℃中恒溫培養,細菌培養1~2d,放線菌培養5~7d,黴菌培養3~5d.觀察生長的菌落,用於進一步純化分離或直接轉接斜麵.

(二)平板製作及劃線分離方法:

1.倒平板:按無菌操作要求,在火焰旁操作,做法如3(1).

2.劃線分離:使用接種環,從待純化的菌落或待分離的斜麵菌種隻沾取少量菌樣,在相應培養基平板中劃線分離,劃線的方法多樣,目的是獲得單個菌落,.

(三)斜麵接種和穿刺接種:

1.斜麵接種

(1)取新鮮固體斜麵培養基,分別做好標記(寫上菌名、接種日期、接種人等),然後用無菌操作方法,把待接菌種接入以上新鮮培養基斜麵上.

(2)接種的方法是,用接種環沾取少量待接菌種,然後在新鮮斜麵上“之”字形劃線,方向是從下部開始,一直劃至上部(圖3—4A).注意劃線要輕,不可把培養基劃破.

(3)接種後30℃ 恒溫培養,細菌培養48h,放線菌、黴菌培養至孢子成熟方可取出保存.

2.穿刺接種

(1)取兩支新鮮半固體牛肉膏蛋白腖柱狀培養基,做好標記(寫上菌名)、接種日期,接種人等).

(2)接種的方法是,用接種針沾取少量待接菌種,然後從柱狀培養基的中心穿入其底部(但不要穿透),然後沿原刺入路線抽出接種針,注意接種針不要移動.

(3)接種後30℃恒溫培養, 24h後觀察,比較兩種菌的生長結果.


四、注意事項

1.一般土壤中,細菌最多,放線菌及黴菌次之,而酵母菌主要見於果園及菜園土壤中,故從土壤中分離細菌時,要取較高的稀釋度,否則菌落連成一片不能計數.

2.在土壤稀釋分離操作中,每稀釋10倍,最好更換一次移液管,使計數準確.

3.放線菌的培養時間較長,故製平板的培養基用量可適當增多.


五、實驗結果

記錄土壤稀釋分離結果,並計算出每克土壤中的細菌、放線菌和黴菌的數量.

計算方法:選擇長出菌落數30~300之間的培養皿進行計數,按以下公式:

總菌數/g=同一稀釋度幾次重複的菌落平均數×稀釋倍數