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微生物常規鑒定技術

來源:青島AG视讯生物科技有限公司發表時間:2017-06-04

一、形態結構和培養特性觀察

1、微生物的形態結構觀察主要是通過染色,在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結構(包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性進行觀察,直觀地了解細菌在形態結構上特性,根據不同微生物在形態結構上的不同達到區別、鑒定微生物的目的。

2、細菌細胞在固體培養基表麵形成的細胞群體叫菌落(colony)。不同微生物在某種培養基中生長繁殖,所形成的菌落特征有很大差異,而同一種的細菌在一定條件下,培養特征卻有一定穩定性。,以此可以對不同微生物加以區別鑒定。因此,微生物培養特性的觀察也是微生物檢驗鑒別中的一項重要內容。

  1)細菌的培養特征包括以下內容:在固體培養基上,觀察菌落大小、形態、顏色(色素是水溶性還是脂溶性)、光澤度、透明度、質地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養中的表麵生長情況(菌膜、環)混濁度及沉澱等。半固體培養基穿刺接種觀察運動、擴散情況。(圖3-8)



圖3-8 細菌的培養特征

1.點狀 2.圓形 3.絲狀 4.不規則形 5.假根狀 6.紡錘狀 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.墊狀 11.臍狀 12.邊緣整齊 13.波狀 14.裂片狀 15.齧蝕狀 16.絲狀 17.卷發狀 18.絲線狀 19.刺毛狀 20.串珠狀 21.疏展狀 22.樹根狀 23.假根狀 24.絲狀 25.串珠狀 26.乳頭狀 27.絨毛狀 28.樹根狀 29.量杯狀 30.蘿卜狀 31.漏鬥狀 32.囊狀 33.層狀 34.絮狀 35.環狀 36.蹼狀 37.膜狀

  2)黴菌酵母菌的培養特征:大多數酵母菌沒有絲狀體,在固體培養基上形成的菌落和細菌的很相似,隻是比細菌菌落大且厚。液體培養也和細菌相似,有均勻生長、沉澱或在液麵形成菌膜。黴菌有分支的絲狀體,菌絲粗長,在條件適宜的培養基裏,菌絲無限伸長沿培養基表麵蔓延。黴菌的基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色,因而菌落邊緣和中心,正麵和背麵顏色常常不同,如青黴菌:孢子青綠色,氣生菌絲無色,基內菌絲褐色。黴菌在固體培養表麵形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網狀菌落。

二、生理生化試驗

  微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產物,生化反應常用來鑒別一些在形態和其它方麵不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一。

  微生物檢驗中常用的生化反應有:

1、糖酵解試驗

  不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異,或能利用或不能利用,能利用者,或產氣或不產氣。可用指示劑及發酵管檢驗。

  試驗方法:以無菌操作,用接種針或環移取純培養物少許,接種於發酵液體培養基管,若為半固體培養基,則用接種針作穿刺接種。接種後,置36±1.0°C培養,每天觀察結果,檢視培養基顏色有無改變(產酸),小倒管中有無氣泡,微小氣泡亦為產氣陽性,若為半固體培養基,則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡,有時還可看出接種菌有無動力,若有動力、培養物可呈彌散生長。

  本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發酵能力,從而進行各種細菌的鑒別,因而每次試驗,常需同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫,溴百裏藍和An-drade指示劑。

2、澱粉水解試驗

  某些細菌可以產生分解澱粉的酶,把澱粉水解為麥芽糖或葡萄糖。澱粉水解後,遇碘不再變藍色。

  試驗方法:以18~24h的純培養物,塗布接種於澱粉瓊脂斜麵或平板(一個平板可分區接種,試驗數種培養物)或直接移種於澱粉肉湯中,於36±1°C培養24~48h,或於20°培養5天。然後將碘試劑直接滴浸於培養表麵,若為液體培養物,則加數滴碘試劑於試管中。立即檢視結果,陽性反應(澱粉被分解)為瓊脂培養基呈深藍色、菌落或培養物周圍出現無色透明環、或肉湯顏色無變化。陰性反應則無透明環或肉湯呈深藍色。

  澱粉水解係逐步進行的過程,因而試驗結果與菌種產生澱粉酶的能力、培養時間,培養基含有澱粉量和pH等均有一定關係。培養基pH必須為中性或微酸性,以pH7.2最適。澱粉瓊脂平板不宜保存於冰箱,因而以臨用時製備為妥。

3、V-P試驗

  某些細菌在葡萄糖蛋白腖水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸,丙酮酸縮合,脫羧成乙酰甲基甲醇,後者在強堿環境下,被空氣中氧氧化為二乙酰,二乙酰與蛋白腖中的胍基生成紅色化合物,稱V-P(+)反應。

  試驗方法:

  1)O’Meara氏法:將試驗菌接種於通用培養基,於36±1°C培養48h,培養液1ml加O’Meara試劑(加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液)1ml,搖動試管1~2min,靜置於室溫或36±1°C恒溫箱,若4h內不呈現伊紅、即判定為陰性。亦有主張在48~50°C水浴放置2h後判定結果者。

  2)Barritt氏法:將試驗菌接種於通用培養基,於36±1°C培養4天、培養液2.5ml先加入5°Cα萘酚(2-na-phthol)純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml,搖動2~5min,陽性菌常立即呈現紅色,若無紅色出現,靜置於室溫或36±1°C恒溫箱,如2h內仍不顯現紅色、可判定為陰性。

  3)快速法:將0.5%肌酸溶液2滴放於小試管中、挑取產酸反應的三糖鐵瓊脂斜麵培養物一接種環,乳化接種於其中,加入5%α-萘酚3滴,40%氫氧化鈉水溶液2滴,振動後放置5min,判定結果。不產酸的培養物不能使用。

  本試驗一般用於腸杆菌科各菌屬的鑒別。在用於芽胞杆菌和葡萄球菌等其它細菌時,通用培養基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產生,故應省去或以氯化鈉代替。

4、甲基紅(Methyl Red)試驗
  腸杆菌科各菌屬都能發酵葡萄糖,在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸,進一步分解中,由於糖代謝的途徑不同,可產生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物,可使培養基PH值下降至pH4.5以下,使甲基紅指示劑變紅。

  試驗方法:挑取新的待試純培養物少許,接種於通用培養基,培養於36±1°C或30°C(以30°C較好)3~5天,從第二天起,每日取培養液1ml,加甲基紅指示劑1~2滴,陽性呈鮮紅色,弱陽性呈淡紅色,陰性為黃色。迄至發現陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結果。

  甲基紅為酸性指示劑,pH範圍為4.4~6.0,其pK值為5.0。故在pH5.0以下,隨酸度而增強黃色,在pH5.0以上,則隨堿度而增強黃色,在pH5.0或上下接近時,可能變色不夠明顯,此時應延長培養時間,重複試驗。

5、靛基質(Imdole)試驗

  某些細菌能分解蛋白腖中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。

  試驗方法:將待試純培養物小量接種於試驗培養基管,於36±1C培養24h時後,取約2ml培養液,加入Kovacs氏試劑2~3滴,輕搖試管,呈紅色為陽性,或先加少量乙醚或二甲苯,搖動試管以提取和濃縮靛基質,待其浮於培養液表麵後,再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數滴,在接觸麵呈紅色,即為陽性。

  實驗證明靛基質試劑可與17種不的靛基質化合物作用而產生陽性反應,若先用二甲苯或乙醚等進行提取,再加試劑,則隻有靛基質或5-甲基靛基質在溶劑中呈現紅色,因而結果更為可靠。

6、硝酸鹽(Nitrate)還原試驗

  有些細菌具有還原硝酸鹽的能力,可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。

  試驗方法:臨試前將試劑的A(磺胺酸冰醋酸溶液)和B(α-萘胺乙醇溶液)試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加於液體培養物或瓊脂斜麵培養物表麵,立即或於10min內呈現紅色即為試驗陽性,若無紅色出現則為陰性。

  用α-萘胺進行試驗時,陽性紅色消退很快、故加入後應立即判定結果。進行試驗時必須有未接種的培養基管作為陰性對照。α-萘胺具有致癌性、故使用時應加注意。

7、明膠(Gelatin)液化試驗

  有些細菌具有明膠酶(亦稱類蛋白水解酶),能將明膠先水解為多肽,又進一步水解為氨基酸,失去凝膠性質而液化。

  試驗方法:挑取18~24h待試菌培養物,以較大量穿刺接種於明膠高層約2/3深度或點種於平板培養基。於20~22℃培養7~14天。明膠高層亦可培養於36±1℃。每天觀察結果,若因培養溫度高而使明膠本身液化時應不加搖動、靜置冰箱中待其凝固後、再觀察其是否被細菌液化,如確被液化,即為試驗陽性。平板試驗結果的觀察為在培養基平板點種的菌落上滴加試劑,若為陽性,10~20min後,菌落周圍應出現清晰帶環。否則為陰性。

8、尿素酶(Urease)試驗

  有些細菌能產生尿素酶,將尿素分解、產生2個分子的氨,使培養基變為堿性,酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導酶,因為不論底物尿素是否存在,細菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。

  試驗方法:挑取18~24h待試菌培養物大量接種於液體培養基管中,搖均,於36±1℃培養10,60和120min,分別觀察結果。或塗布並穿刺接種於瓊脂斜麵,不要到達底部,留底部作變色對照。培養2,4和24h分別觀察結果,如陰性應繼續培養至4天,作最終判定,變為粉紅色為陽性。

9、氧化酶(Oxidase)試驗

  氧化酶亦即細胞色素氧化酶,為細胞色素呼吸酶係統的終末呼吸酶,氧化酶先使細胞色素C氧化,然後此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化,產生顏色反應。

  試驗方法:在瓊脂斜麵培養物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴,陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色,Ewing氏改進試劑呈藍色。陰性者無顏色改變。應在數分鍾內判定試驗結果。

10、硫化氫(H2S)試驗

  有些細菌可分解培養基中含硫氨基酸或含硫化合物,而產生硫化氫氣體,硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉澱物。

  試驗方法:在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養基中,沿管壁穿刺接種,於36±1℃培養24~28h,培養基呈黑色為陽性。陰性應繼續培養至6天。也可用醋酸鉛紙條法:將待試菌接種於一般營養肉湯,再將醋酸鉛紙條懸掛於培養基上空,以不會被濺濕為適度;用管塞壓住置36±1℃培養1~6天。紙條變黑為陽性。

11、三糖鐵(TSI)瓊脂試驗

  試驗方法:以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養物,穿刺接種並塗布於斜麵,置36±1℃培養18~24h,觀察結果。

  本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發酵產酸或產酸產氣(變黃);產生硫化氫(變黑)。葡萄糖被分解產酸可使斜麵先變黃,但因量少,生成的少量酸,因接觸空氣而氧化,加之細菌利用培養基中含氮物質,生成堿性產物,故使斜麵後來又變紅,底部由於是在厭氧狀態下,酸類不被氧化,所以仍保持黃色。

12、硫化氫-靛基質-動力(SIM)瓊脂試驗

  試驗方法:以接種針挑取菌落或純養物穿刺接種約1/2深度,置36±1℃培養18~24h,觀察結果。培養物呈現黑色為硫化氫陽性,混濁或沿穿刺線向外生長為有動力,然後加Kovacs氏試劑數滴於培養表麵,靜置10min,若試劑呈紅色為靛基質陽性。培養基未接種的下部,可作為對照。

  本試驗用於腸杆菌科細菌初步生化篩選,與三糖鐵瓊脂等聯合使用可顯著提高篩選功效。

三、血清學試驗

  血清學反應是指:相應的抗原與抗體在體外一定條件下作用,可出現肉眼可見的沉澱、凝集現象。在食品微生物檢驗中,常用血清學反應來鑒定分離到的細菌,以最終確認檢測結果。

  血清學反應的一般特點:

  1)抗原體的結合具有特異性,當有共同抗原體存在時,會出現交叉反應。

  2)抗原體的結合是分子表麵的結合,這種結合雖相當穩定,但是可逆的。

  3)抗原體的結合是按一定比例進行的,隻有比例適當時,才能出現可見反應。

  4)血清學反應大體分為兩個階段進行,但其間無嚴格界限。第一階段為抗原體特異性結合階段,反應速度很快,隻需幾秒至幾分鍾反應即可完畢,但不出現肉眼可見現象。第二階段為抗原體反應的可見階段,表現為凝集、沉澱、補體結合反應等。反應速度慢,需幾分、幾十分以至更長時間。而且,在第二階段反應中,電解質、PH、溫度等環境因素的變化,都直接影響血清學反應的結果。

  習慣上將經典的血清學反應分三種類別:凝集反應、沉澱反應和補體結合反應。

1、凝集反應

  顆粒性抗原(細菌、紅細胞等)與相應抗體結合,在電解質參與下所形成的肉眼可見的凝集現象,稱為凝集反應(Agglutination reaction)。其中的抗原稱為凝集原,抗體稱為凝集素。在該反應中,因為單位體積抗體量大,做定量實驗時,應稀釋抗體。

  1)直接凝集反應

  顆粒性抗原與相應抗體直接結合所出現的反應,稱為直接凝集反應(Direct agglution reaction)。

  a.玻片凝集法。是一種常規的定性試驗方法。原理是用已知抗體來檢測未知抗原。常用於鑒定菌種、血型。如將含有痢疾杆菌抗體的血清與待檢菌液各一滴,在玻片上混勻,數分種後若出現肉眼可見的凝集塊,即陽性反應,證明該菌是痢疾杆菌。此法快速、簡便,但不能進行定量測定。

  b.試管凝集法。是一種定量試驗方法。多用已知抗原來檢測血清中有無相應抗體及其含量。常用於協助診斷某些傳染病及進行流行病學調查。如肥達氏反應就是診斷傷寒、付傷寒的試管凝集試驗。因為要測定抗體的含量,故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀釋成不同濃度,然後加入等量抗原,37℃或56℃,2~4小時觀察,血清最高稀釋度仍有明顯凝集現象的,為該抗血清的凝集效價。

  2)間接凝集反應

  將可溶性抗原(抗體)先吸附在一種與免疫無關的,顆粒狀微球表麵,然後與相應抗體(抗原)作用,在有電解質存在的條件下,即可發生凝集,稱為間接凝集反應(Indirect agglutination)。由於載體增大了可溶性抗原的反應麵積。當載體上有少量抗原與抗體結合。就出現肉眼可見的反應,敏感性很高。

2、沉澱反應

  可溶性抗原與相應抗體結合,在有適量電解質存在下,經過一定時間,形成肉眼可見的沉澱物,稱為沉澱反應(Precipitation)。反應中的抗原稱為沉澱原,抗體為沉澱素。由於在單位體積內抗原量大,為了不使抗原過剩,故應稀釋抗原,並以抗原的稀釋度作為沉澱反應的效價。

  1)環狀沉澱反應:是一種定性試驗方法,可用已知抗體檢測未知抗原。將已知抗體注入特製小試管中,然後沿管壁徐徐加入等量抗原,如抗原與抗體對應,則在兩液界麵出現白色的沉澱圓環。

  2)絮狀沉澱反應:將已知抗原與抗體在試管(如凹玻片)內混勻,如抗原抗體對應,而又二者比例適當時,會出現肉眼可見的絮狀沉澱,此為陽性反應。

  3)瓊脂擴散試驗:利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內擴散,若抗原抗體對應,且二者比例合適,在其擴散的某一部分就會出現白色的沉澱線。每對抗原抗體可形成一條沉澱線。有幾對抗原抗體,就可分別形成幾條沉澱線。瓊脂擴散可分為單向擴散和雙向擴散兩種類型。單向擴散是一種定量試驗。可用於免疫蛋白含量的測定。而雙向擴散多用於定性試驗。由於方法簡便易行,常用於測定分析和鑒定複雜的抗原成分。

3、補體結合反應

  補體結合反應(Complement fixation reaction)是在補體參與下,以綿羊紅細胞和溶血素作為指示係統的抗原抗體反應。補體無特異性,能與任何一組抗原抗體複合物結合而引起反應。如果補體與綿羊紅細胞、溶血素的複合物結合,就會出現溶血現象,如果與細菌及相應抗體複合物結合,就會出現溶菌現象。因此,整個試驗需要有補體、待檢係統(已知抗體或抗原、未知抗原或抗體)及指示係統(綿羊細胞和溶血素)五種成份參加。其試驗原理是補體不單獨和抗原或抗體結合。如果出現溶菌,是補體與待檢係統結合的結果,說明抗原抗體是相對應的,如果出現溶血,說明抗原抗體不相對應。此反應操作複雜,敏感性高,特異性強,能測出少量抗原和抗體,所以應用範圍較廣。